PCR какво е
Полимеразна верижна реакция (PCR. В PCR) изобретен през 1983 г., Keri Myullis (Американски учен). Впоследствие той получи Нобелова награда за изобретение. Понастоящем PCR диагностика е един от най-точни и чувствителни методи за диагностика на инфекциозни заболявания.
Полимеразна верижна реакция (PCR) - експериментален метод на молекулярната биология, методът значително увеличаване на концентрацията на някои малки фрагменти от нуклеинови киселини (ДНК) в биологичния материал (проба).
Освен просто увеличаване на броя на ДНК копия (този процес се нарича усилване), PCR позволява много други манипулации на генетичен материал (въвеждане на мутации, снаждане ДНК фрагменти), и се използва широко в биологична и медицинска практика, например, за диагностициране (генетични, инфекциозен) за бащинство, за генна клониране, въвеждане на мутации изолиране на нови гени.
Специфика и прилагане
PCR - метод за молекулярна диагностика на редица инфекции превърне в теста "златен стандарт" от време и внимателно тествани клинично. PCR метод за определяне на наличието на причинителя, дори ако пробата съдържа само няколко ДНК молекули на патогена.
PCR позволява да се диагностицира наличието на дълъг вегетационен патогени, без да се прибягва до отнемащи време микробиологичните методи, което е особено важно в гинекологията и урологията при диагностицирането на урогенитални инфекции, полово предавани инфекции (ППИ).
Също така, този метод се извършва диагностика на вирусни инфекции. като хепатит. HIV и други. Чувствителността на метода е значително превъзхожда че в immunohomicheskih и микробиологични методи, и принципа на метода за диагностициране на наличието на инфекция със значително антигенен вариант.
Спецификата на PCR с помощта на PCR технология дори за всички вируси, хламидии, микоплазма, Ureaplasma, както и повечето други бактериални инфекции достига 100%. PCR метод може да открие дори единични клетки на бактерии или вируси. PCR диагностика откриване присъствието на инфекциозни агенти в случаи, когато други методи (имунологичен, бактериологични, микроскопични) не могат да направят това.
PCR метод е особено ефективен за диагностика трудно култивирани, некултурни и скрити форми на съществуващите микроорганизми, които са често срещани в латентни и хронични инфекции, като този метод се избягва трудностите, свързани с отглеждането на тези микроорганизми ин витро.
Използването на PCR диагностика също много ефективни срещу патогени с висока антигенна изменчивост и вътреклетъчни паразити. PCR откриване е възможно не само патогени в клиничен материал, получен от пациента, но също така и в материали, получени от обектите на околната среда (вода, почвата и така нататък. Г.). В урологични и гинекологични практика - за откриване на хламидия, ureaplasmosis. гонорея, херпес, gardnerelloza, микоплазмени инфекции, HPV - човешки папиломавирус; в пулмология - за диференциална диагноза на вирусен и бактериален пневмония, туберкулоза; в гастроентерологията - да се идентифицират helikobakterioza; инфекциозни болести в клиниката - като бърз метод за диагностика на салмонелоза, дифтерия, хепатит В, С и G; по хематология - за откриване на CMV инфекция, Онковируси.
Специфична характеристика на PCR се основава на образуването на комплекси между комплементарни шаблон и праймери - къси синтетични олигонуклеотиди с дължина от 18 - 30 букви. Всяка от сравними праймери (допълнителни) с една верига на двойно-верижен шаблон, фланкиращи началото и в края на амплифицираната част.
След съединение (хибридизация) с праймер на шаблон (отгряване), последният служи като праймер за ДНК полимераза по време на синтез на комплементарна верига шаблон.
За PCR изисква следните компоненти в най-простия случай:
- шаблон ДНК, съдържащ ДНК региона, което е необходимо да се разширят;
- Два праймера, комплементарни на желаните краища на фрагмента;
- термостабилна ДНК полимераза;
- дезоксинуклеотид трифосфати (A, G, С, Т);
- Mg2 + йони, необходимо за полимераза;
- буферен разтвор.
PCR се провежда в термоциклер - устройства, осигуряващи периодични охладителни и отоплителни тръби, обикновено с точност не по-малко от 0,1 ° С За да се предотврати изпаряване на реакционната смес се прибавя в тръбата масло висока точка на кипене, като течен парафин. Добавянето spetsifichekih ензими може да увеличи добива на реакцията PCR.
Обикновено, когато PCR се извършва на 20 - 35 цикъла, като всеки се състои от три етапа. Двойноверижна ДНК шаблон се загрява до 94-96 ° С (или до 98 ° С, особено при използване на термостабилна полимераза) 0.5 - 2 минути до ДНК нишка диспергирани. Този етап се нарича денатурация - пробие водородните връзки между двете вериги. Понякога, преди първия цикъл се осъществява предварително нагряване на реакционната смес в продължение на 2 - 5 минути за пълно денатуриране на шаблон и праймери.
Когато скъса, температурата се понижава до грундове влезете във връзка с едноверижната матрица. Този етап се нарича закаляване. Температурата на отгряване зависи от праймерите и обикновено избран в продължение на 4 - 5 ° C под тяхната температура на топене. Етап време - 0,5 - 2 минута.
ДНК полимераза репликира матрица верига използва праймер като праймер. Това - на етапа на удължаване. температура удължение зависи от полимеразата. Често използвани най-активната полимераза при 72 ° С време удължаване зависи както от вида на ДНК полимераза, а дължината на амплифицирания фрагмент. Обикновено времето за удължаване трябва да бъде равна на една минута за всеки хиляда базови двойки. След приключване на всички цикли често се извършва по-нататъшна стъпка на крайния удължаване, за да завършите всички едноверижни фрагменти. Този етап продължава в продължение на 10 - 15 мин.
Подготовка на материала за изследване и го транспорт до лабораторията
За успеха на анализа е важно правилно да се събере материал от пациента и провежда обучението си правилно. Известно е, че в повечето грешки лабораторна диагностика (до 70%) се извършва на етапа на подготовката на пробите. За кръв в лаборатория за ин се използват сега вакуумни системи, които от една страна най-малко нараняват на пациента, но от друга - може да направи заснемане материал по такъв начин, че не е в контакт с персонала, нито за околната среда. Това избягва замърсяване (заразяване) на материал и осигурява обективност PCR анализ.
ДНК - дезоксирибонуклеинова киселина - биологична полимер, един от двата вида на нуклеинови киселини, осигурява съхранение, предаване поколения и реализация на генетичната програма на развитието и функционирането на живите организми. Основната роля на ДНК в клетки - дългосрочно съхранение на информация за структурата на РНК и протеини.
РНК - рибонуклеинова киселина - биологична полимер, близки по химическа структура на ДНК. молекула РНК изработена от същите мономерни единици - нуклеотиди като ДНК. В природата, РНК, обикновено съществува като единична верига. Някои вирусна РНК е носител на генетичната информация. В клетката, играе важна роля в предаването на информация от ДНК протеин. РНК се синтезира на ДНК матрица. Този процес се нарича транскрипция. ДНК има области, където информация отговорен за синтеза на три вида РНК различни от функция: информация или месинджър РНК (тРНК), рибозомни (рРНК) и транспорт (тРНК). И трите вида РНК по някакъв начин участва в синтеза на протеини. Въпреки това, информация за синтеза на протеин се намира само в иРНК.
Нуклеотидите - основния повтаряща се единица в молекули на нуклеинови киселини, химически съединения азотна база продукт, пет въглерод захар (пентозни) и една или повече фосфатни групи. Нуклеотидите показани на нуклеинови киселини, съдържащи една фосфатна група. Те се наричат в те съдържат азотни бази - аденин (А), съдържащ аденин, гуанин (G) - гуанин, цитозин (С) - цитозин, тимин (Т) - тимин, урацил (U) - урацил. Съставът включва четири типа ДНК нуклеотидна - А, Т, G, С, от типа на РНК и 4 - А, U, G, С захар състои от всички ДНК е деоксирибоза нуклеотиди, РНК - рибоза. При образуването на нуклеинови киселини, нуклеотиди, чрез свързване за образуване на захар-фосфатен гръбнак на молекулата, от едната страна на която са основа.
Primer - kotrotkaya ДНК се използва за репликацията на верига шаблон. Всеки един от праймерите е комплементарна на една верига на двойно-верижен шаблон, фланкиращи началото и в края на амплифицираната част.